hsa

May 15, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12544 (2023) Diesen Artikel zitieren

189 Zugriffe

Details zu den Metriken

Die vorliegende Studie untersuchte die Expression von microRNA (miR)-199b-3p bei Osteosarkomen (OS) und zielte darauf ab, den möglichen Wirkmechanismus zu identifizieren, der zur Entwicklung dieser Krankheit beiträgt. Zunächst wurden die Expressionsdaten von miR-199b-3p und der Coiled-Coil-Domäne mit 88A (CCDC88A) anhand der interaktiven Analyse des Genexpressionsprofils ausgewertet und ein Kaplan-Meier-Plotter zur Auswertung der Überlebensdaten verwendet. Durch die Analyse des GSE65071-Datensatzes aus dem Genexpressions-Omnibus wurde festgestellt, dass miR-199b-3p in geringem Maße exprimiert wurde. Mithilfe einer quantitativen Reverse-Transkription-PCR-Analyse in OS-Zellen und -Geweben wurde festgestellt, dass CCDC88A in hohem Maße exprimiert wird. Darüber hinaus sagte TargetScan voraus, dass CCDC88A ein Downstream-Ziel von miR-199b-3p sein wird. Zur Verifizierung dieser Vorhersage wurden Luciferase-Reporter-Assays verwendet. In-vitro-Überexpression von miR-199b-3p verringerte die invasive und proliferative Aktivität von OS-Zellen. Mechanistische Studien zeigten, dass eine verminderte miR-199b-3p zu einer erhöhten Expression von CCDC88A führte. Gleichzeitig behinderte es den Wnt/Beta-Catenin-Weg und den Übergangsprozess vom Epithel zum Mesenchym. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse der vorliegenden Studie die zentrale Rolle des miR-199b-3p bei der Entstehung und dem Fortschreiten des OS, was darauf hindeutet, dass es als potenzieller Tumorbiomarker verwendet werden könnte.

Osteosarkom (OS) ist eine Krankheit, die am häufigsten Kinder und Jugendliche betrifft. Es gilt als eines der häufigsten primär bösartigen Knochensarkome mit einer schlechten Prognose1. Die chirurgische Resektion aller Tumorstellen, Strahlentherapie und Chemotherapie sind die drei Haupttherapien zur Behandlung von Patienten mit OS2. Trotz erheblicher Anstrengungen bei der OS-Behandlung liegt die 5-Jahres-Überlebensrate weiterhin zwischen 50 und 80 % und die Überlebensraten sind seit 1980 unverändert3,4. Um die Überlebensrate der Patienten zu erhöhen und das Fortschreiten des OS zu hemmen, ist daher die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und ihrer molekularen Mechanismen dringend erforderlich.

MicroRNAs (miRs) sind eine Art nichtkodierender kleiner RNAs mit einer ungefähren Länge von 21–23 Nukleotiden. Es wurde berichtet, dass bestimmte miRs zum Fortschreiten des OS beitragen und bei der Diagnose, Prognose und Behandlung dieser Krankheit eingesetzt werden können5,6,7. Einige Studien haben auch herausgefunden, dass miR die Metastasierung und Invasion von Osteosarkomen beeinflusst8. Beispielsweise kann eine Herunterregulierung von miR-34a den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) aktivieren und die Metastasierung von Osteosarkomen fördern9. LINC00210 modulierte die Strahlenempfindlichkeit von Osteosarkomzellen über die miR-342-3p/GFRA1-Achse und machte LINC00210 zu einem neuen Ziel für die Verbesserung der Strahlentherapieeffizienz bei Osteosarkomen10. Eine hochregulierte Expression von miR-664a könnte eine hemmende Wirkung auf die MEG3-Genexpression und die Migration von Osteosarkomzellen haben11. MiR-659-3p hemmte das Fortschreiten des Osteosarkom-Tumors und die Lungenmetastasierung, indem es die SRPK1-Expression und möglicherweise die nachgeschaltete Zellproliferation sowie die Gene für den Übergang vom Epithel zum Mesenchym hemmte12. Die hohe Expression von miR-183 kann den Wnt/Beta-Catenin-Weg hemmen und die Metastasierung von Osteosarkomen hemmen13. Frühere Forschungsstudien haben ergeben, dass miR-199b-3p die Proliferation, Differenzierung und Apoptose in einer Vielzahl von Tumoren beeinflussen kann14,15. Über die Rolle von miR-199b-3p im Betriebssystem wurde jedoch bisher nicht berichtet.

Die 88A enthaltende Coiled-Coil-Domäne (CCDC88A) kann an das Aktin-Zytoskelett binden. Akt ist eine Serin/Threonin-Kinase, die für die gerichtete Zellmigration erforderlich ist, die letztendlich zur Invasion und Metastasierung von Krebszellen führt16. Mehrere Berichte deuten darauf hin, dass CCDC88A an der Tumorprogression beteiligt ist. Die Unterdrückung der CCDC88A-Expression unterdrückt die Migration und Invasion menschlicher Bauchspeicheldrüsen-, Haut- und Brustkrebszellen und hemmt die primäre Tumorentstehung in vivo erheblich17,18,19, was darauf hindeutet, dass CCDC88A eine Schlüsselrolle bei der Krebsentstehung spielt.

In der vorliegenden Studie haben wir zunächst gezeigt, dass miR-199b-3p eine tumorsuppressive Funktion bei OS hat, indem es das Wachstum, die Migration und die Invasion von OS-Zellen unterdrückt. Anschließend haben wir CCDC88A als direktes Ziel von miR-199b-3p charakterisiert. MiR-199b-3p interagierte mit der 3'UTR von CCDC88A, um den EMT- und Wnt/Beta-Catenin-Signalweg zu hemmen und so seine tumorsuppressive Wirkung auf die Proliferation und Invasion von OS-Zellen zu vermitteln. Diese Erkenntnisse können für die Entwicklung möglicher klinischer Ansätze zur OS-Behandlung nützlich sein.

Das Gesamtüberleben der Patienten mit OS und unterschiedlichen miR-199b-3p-Expressionsniveaus wurde mit dem Kaplan-Meier-Plotter (http://kmplot.com/analysis/) analysiert. Die CCDC88A-Expressionsdaten und prognostischen Informationen wurden von der Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)-Datenbank (http://gepia.cancer-pku.cn) abgerufen. GSE65071 wurde verwendet, um die miR-199b-3p-Expressionsdaten aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) zu erfassen. Die mögliche Assoziation zwischen miR-199b-3p und CCDC88A wurde von TargetScan (http://www.targetscan.org/vert 80/) ermittelt.

Insgesamt wurden 49 Patienten eingeschlossen, die sich von 2010 bis 2020 in unserem Krankenhaus einer chirurgischen Behandlung unterzogen haben. Insgesamt wurden 49 Paare von primärem OS und angrenzendem, nicht krebsartigem Knochengewebe gewonnen. Alle Gewebe wurden gesammelt und während der Operation sofort bei –80 °C kryokonserviert. Zur Bestätigung der OS-Diagnose wurden die histologischen Kriterien der Weltgesundheitsorganisation und das Stadiensystem des American Joint Committee on Cancer (AJCC) herangezogen. Für die Bewertung der Prognose und des Überlebens von Patienten mit OS20 wurde das AJCC-Staging-System empfohlen.

Die Einschlusskriterien waren wie folgt: Osteosarkompatienten mit einem erwarteten Überleben von mehr als 3 Monaten ohne Strahlentherapie oder Chemotherapie vor der Operation. Die Ausschlusskriterien waren wie folgt: (i) Osteosarkompatienten, die vor der Operation eine Strahlentherapie oder Chemotherapie erhielten; und (ii) Patienten, die nicht kooperiert haben, unterzeichnen die Einverständniserklärung.

Der Vorschlag wurde vor der Umsetzung von der Ethikkommission unseres Krankenhauses geprüft und genehmigt (Oktober 2020; Genehmigungsnr. 2020119). Von den Erziehungsberechtigten der in die vorliegende Studie einbezogenen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Alle Zelllinien, einschließlich hFOB, MG63 (RRID: CVCL_0426) und U2OS, wurden von der Suzhou Culture Collection erworben. Alle Zelllinien wurden durch STR-Analyse authentifiziert. Für die Zellkultur wurde DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) mit 10 % FBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), Streptomycin (100 μg/ml) und Penicillin (100 U/ml) verwendet. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert.

TRIzol (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) wurde verwendet, um die Gesamt-RNA aus Zellen und Geweben gemäß den Anweisungen der Kits zu extrahieren. β-Actin und U6 wurden als interne Referenzkontrollen von CCDC88A bzw. miR-199b-3p verwendet. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

miR-199b-3p-Mimetika, miR-199b-3p-Inhibitor, auf CCDC88A gerichtete siRNA und ihre entsprechenden Kontrollgruppen wurden von Shanghai Genepharma Inc. erworben. Die Methode der siRNA-Transfektion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt21. Die verwendeten Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Nach der Transfektion wurden U2OS- und MG63-Zellen mit einer Dichte von 1000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Als Replikate wurden insgesamt 5 Vertiefungen verwendet. Insgesamt 10 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reagenz (5 mg/ml) wurden mit den Zellen inkubiert (0, 24, 48 und 72 Stunden). Gruppen) bei 37 °C für 2 h. Anschließend wurden 150 μl Dimethylsulfoxid in die Vertiefungen gegeben. Zur Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 490 nm wurde ein Mikroplatten-Lesegerät verwendet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die Transwell-Kammer wurde verwendet, um die Migrationsfähigkeit von OS-Zellen zu untersuchen. Insgesamt 200 μl Zellsuspension nur mit DMEM wurden in die obere Kammer ausplattiert und 500 μl DMEM mit 20 % FBS wurden in die untere Kammer gegeben. Anschließend wurden die Zellen 48 Stunden lang inkubiert und die Zellen, die nicht durch die Membranoberfläche durchdrangen, mit einem Wattestäbchen entfernt. Die verbleibenden Zellen wurden mit PBS gespült und mit Paraformaldehyd 10 Minuten lang fixiert, gefolgt von einer Färbung mit 0,5 % Kristallviolett. Die Anzahl der Zellen, die die Membran durchdrangen, wurde mit einem Umkehrmikroskop gezählt. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

MG63- und U2OS-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Anschließend wurden Wildtyp (wt) oder mutierte 3′-untranslatierte Region (UTR) von CCDC88A, miR-199b-3p-Mimetikum/Inhibitor und Negativkontrolle (NC) mit einem Lipofectamine™ 2000-Kit (Invitrogen) in die oben genannten Zellen transfiziert ; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden lang kultiviert und das Zelllysat gesammelt, um die Luciferase-Aktivität mithilfe eines Dual-Luciferase-Reportergen-Assay-Systems zu messen. Die verwendeten Mimic/Inhibitor- und NC-Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt (Ergänzende Informationen).

RIPA-Puffer (Biosharp Life Sciences) wurde verwendet, um die Gesamtproteine ​​aus MG63- und U2OS-Zellen zu extrahieren, und der Bradford-Proteintest (Bio-Rad Laboratories, Inc.) wurde zur Durchführung der Proteinquantifizierung verwendet. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 12 % SDS-PAGE-Gelen durchgeführt und die Proteine ​​wurden auf Polyvinylidenfluoridmembranen (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen. Anschließend wurden sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Milch blockiert. Die Membranen wurden zugeschnitten und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenzreagenzien (Pierce; Thermo Fisher Scientifc, Inc.) entwickelt. Zur Messung der Grauwerte wurde die ImageJ-Software (Version 1.42; National Institutes of Health) verwendet. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Antikörper sind in Tabelle 3 aufgeführt. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Die Daten wurden mit GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.) analysiert. Zur Bestimmung der Unterschiede in den quantitativen Daten wurden die ungepaarten oder gepaarten Student-T-Tests verwendet. Die kategorialen Variablen wurden mit dem χ2-Test oder dem exakten Fisher-Test bewertet. Die prognostische Signifikanz wurde durch Kaplan-Meier- und Log-Rank-Analysen bestimmt. Für die Biomarker-Vorhersage wurden die Receiver Operating Curve (ROC) und die Fläche unter der Kurve (AUC) verwendet. Die Pearson-Korrelation wurde verwendet, um die Stärke der linearen Korrelation zwischen zwei kontinuierlichen Variablen zu bewerten. P < 0,05 wurde als Hinweis auf einen signifikanten Unterschied angesehen.

Das Protokoll wurde von der Ethikkommission des Zweiten Volkskrankenhauses von Lianyungang (Lianyungang, China) gemäß den Richtlinien der Ethikkommission genehmigt. Und alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den oben genannten relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Alle Patienten und/oder ihre Erziehungsberechtigten unterzeichneten eine Einverständniserklärung.

Eine erhöhte Expression von miR-199b-3p war mit dem Gesamtüberleben von Patienten mit OS verbunden, wie mit dem Kaplan-Meier-Plotter bestimmt (Abb. 1A). Nach Analyse der öffentlichen GEPIA-Datenbank wurde festgestellt, dass die relative Expression von CCDC88A in OS-Geweben signifikant höher ist (Abb. 1B); Es wurde auch gezeigt, dass es mit einem schlechten Gesamtüberleben verbunden ist (Abb. 1C). Basierend auf GSE65071 waren die miR-199b-3p-Expressionsniveaus in OS-Proben dramatisch verringert (Abb. 1D). Differenziell exprimierte miRNAs wurden mithilfe eines Vulkandiagramms zwischen OS- und normalen Proben analysiert (Abb. 1E). Die Heatmap zeigt die partielle differentielle miRNA-Expression im OS (Abb. 1F).

Die Expressionsniveaus von miR-199b-3p und CCDC88A werden im OS beurteilt und stehen im Zusammenhang mit der Krankheitsprognose, die durch bioinformatische Analyse bestimmt wird. (A) Die Patienten mit OS und hoher miR-199b-3p-Expression zeigten ein günstiges Überleben (Daten aus dem Kaplan-Meier-Plotter). (B) Die CCDC88A-Expression auf mRNA-Ebene war in 262 Tumorgeweben hoch und in 2 normalen Geweben niedrig (Daten von GEPIA). (C) Patienten mit OS und hoher CCDC88A-Expression zeigten ein schlechtes Überleben (Daten von GEPIA). (D) Basierend auf GSE65071 waren die miR-199b-3p-Expressionsniveaus in OS-Proben dramatisch verringert. (E) Differenziell exprimierte miRNAs wurden mithilfe eines Vulkandiagramms zwischen OS- und normalen Proben analysiert (Daten von GSE65071). (F) Die Wärmekarte zeigt die partielle differenzielle miRNA-Expression in OS (Daten von GSE65071). *P < 0,05, ***P < 0,001. miR microRNA, CCDC88A Coiled-Coil-Domäne mit 88A, OS-Osteosarkom, interaktive GEPIA-Genexpressionsprofilanalyse.

Die Expressionsniveaus von CCDC88A waren in Tumorgeweben aus klinischen Proben höher (Abb. 2A), wohingegen die von miR-199b-3p niedriger waren (Abb. 2B). Die CCDC88A-Spiegel waren in Tumorzellen im Vergleich zu denen der normalen Osteoblastenzelllinie hFOB1.19 erhöht (Abb. 2C). Allerdings waren die Expressionsniveaus von miR-199b-3p in OS-Zelllinien verringert (Abb. 2D). Bei Patienten mit OS wurde eine negative Korrelation zwischen CCDC88A- und miR-199b-3p-Expression festgestellt (P = 0,005, r = – 0,39; Abb. 2E). Der beste Grenzwert wurde durch ROC-Analyse ermittelt und zwei Gruppen wurden basierend auf den Expressionsniveaus von miR-199b-3p ausgewählt (P = 0,004, AUC = 0,67; Abb. 2F). Anschließend wurden die Gruppe mit hoher Expression (n = 15) und die Gruppe mit niedriger Expression (n = 34) erhalten (Tabelle 4). Es wurde festgestellt, dass Tumorgröße, Fernmetastasierung und klinisches Stadium signifikant mit niedrigen Expressionsniveaus von miR-199b-3p assoziiert sind (P = 0,015, P = 0,047 bzw. P = 0,029). Niedrige miR-199b-3p-Expressionsniveaus waren mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit OS verbunden (P = 0,024) (Abb. 2G).

Bestimmung der Expressionsniveaus von miR-199b-3p und CCDC88A im OS und Zusammenhang mit der Krankheitsprognose. (A) Die CCDC88A-Expressionsniveaus in den OS-Proben waren höher als die in den normalen Proben, wie durch RT-qPCR-Analyse bestimmt. (B) Die miR-199b-3p-Expressionsniveaus in den OS-Proben waren niedriger als die in den normalen Proben, wie durch RT-qPCR-Analyse festgestellt wurde. (C) Die mRNA-Expressionsniveaus von CCDC88A waren in OS-Zelllinien höher als in den menschlichen Osteoblastenzellen, wie durch RT-qPCR-Analyse bestimmt. (D) Die Expressionsniveaus von miR-199b-3p waren in OS-Zelllinien niedriger als in menschlichen Osteoblastenzellen, wie durch RT-qPCR-Analyse bestimmt. (E) Negative Korrelation zwischen miR-199b-3p- und CCDC88A-Ausdrücken. (F) Der Grenzwert von miR-199b-3p wurde bei Patienten mit OS bewertet. (G) Bestimmung der Überlebenskurven für Patienten mit OS im Hinblick auf die miR-199b-3p-Expression. *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001. miR-microRNA, CCDC88A-Coiled-Coil-Domäne mit 88A, OS-Osteosarkom, RT-qPCR-Reverse-Transkription-Quantitative-Polymerase-Kettenreaktion, AUC-Fläche unter der Kurve. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Ein miR-199b-3p-Mimetikum oder -Inhibitor wurde in MG63- und U2OS-Zellen transfiziert, um eine Hoch- oder Herunterregulierung der miR-199b-3p-Expression zu induzieren. RT-qPCR wurde verwendet, um die Effizienz des Transfektionsprozesses nachzuweisen (Abb. 3A, B). Die Ergebnisse der MTT-Assays zeigten, dass die Proliferation der OS-Zelllinien nach der Transfektion der Zellen mit miR-199b-3p-Mimetika deutlich verringert war, während die der OS-Zelllinien nach der Transfektion der Zellen mit miR-199b-3p gefördert wurde. 3p-Inhibitoren (Abb. 3C,D). Transwell-Assays zeigten, dass die Migrationsaktivität der OS-Zelllinien nach der Transfektion der Zellen mit miR-199b-3p-Mimetika deutlich verringert war, während die Transfektion der Zellen mit den miR-199b-3p-Inhibitoren die Migrationsaktivität der OS-Zellen förderte ( Abb. 3E).

Die Proliferation und Invasion von OS-Zellen wird durch miR-199b-3p unterdrückt. (A) Die Expressionsniveaus von miR-199b-3p wurden durch RT-qPCR in MG63-Zellen gemessen, die mit miR-Mimetika und einem miR-Inhibitor transfiziert waren. (B) Die Expressionsniveaus von miR-199b-3p wurden durch RT-qPCR in U2OS-Zellen gemessen, die mit miR-Mimetika und einem miR-Inhibitor transfiziert waren. (C) Die MTT-Analyse zeigte die proliferative Aktivität von MG63-Zellen, die mit miR-199b-3p-Mimetika und einem miR-Inhibitor transfiziert waren. (D) Die MTT-Analyse zeigte die proliferative Aktivität von U2OS-Zellen nach der Transfektion mit miR-199b-3p-Mimetika und einem miR-Inhibitor. (E) Die Migrationsaktivität wurde nach der Zunahme und Abnahme der Expressionsniveaus von miR-199b-3p in MG63- und U2OS-Zellen gemessen. *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001. OS-Osteosarkom, miR-microRNA, RT-qPCR Reverse-Transkription-quantitative Polymerasekettenreaktion, MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, OD optische Dichte. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Frühere Experimente ergaben, dass CCDC88A 3'UTR und miR-199b-3p eine mutmaßliche Bindungsstelle aufwiesen, wie durch die TargetScan-Datenbank bestimmt (Abb. 4A). Der Luciferase-Reportergen-Assay zeigte in der CCDC88A-wt-Gruppe, dass die Luciferase-Aktivität durch miR-199b-3p-Mimetika signifikant gehemmt wurde (Abb. 4B, C), während in der CCDC88A-wt-Gruppe die Luciferase-Aktivität durch miR-199b gefördert wurde -3p-Hemmung (Abb. 4D, E). Anschließend wurden die CCDC88A-Spiegel mittels RT-qPCR gemessen, um festzustellen, ob miR-199b-3p die CCDC88A-Expression verändern könnte. Darüber hinaus waren die Expressionsniveaus von CCDC88A in der miR-199b-3p-Mimetika-Gruppe verringert und in der miR-199b-3p-Inhibitor-Gruppe im Vergleich zu denen der NC-Gruppe erhöht (Abb. 4F, G). Daher wurde der Schluss gezogen, dass miR-199b-3p einen signifikanten Einfluss auf das OS hatte, indem es auf CCDC88A abzielte.

miR-199b-3p reguliert die Expressionsniveaus von CCDC88A durch direkte Bindung an seinen 3'UTR herunter. (A) Die gemeinsame Zielstelle von miR-199b-3p und CCDC88A 3′UTR. (B–E) Luciferase-Reportergen-Assays. (F) Bestimmung der Expressionsniveaus von CCDC88A in MG63-Zellen nach Transfektion mit miR-199b-3p-Mimetika/Inhibitoren. (G) Bestimmung der Expressionsniveaus von CCDC88A in U2OS-Zellen nach Transfektion mit miR-199b-3p-Mimetika/Inhibitoren. (H) Die mRNA-Expressionsniveaus von CCDC88A wurden in MG63-Zellen bewertet, die mit CCDC88A-siRNA durch RT-qPCR co-transfiziert wurden. (I) Die mRNA-Expressionsniveaus von CCDC88A in mit CCDC88A-siRNA kotransfizierten U2OS-Zellen wurden durch RT-qPCR nachgewiesen. (J) Die mRNA-Spiegel von CCDC88A in MG63-Zellen, die mit CCDC88A-siRNA und dem miR-199b-3p-Inhibitor co-transfiziert waren, wurden durch RT-qPCR nachgewiesen. (K) Die mRNA-Spiegel von CCDC88A in U2OS-Zellen, die mit CCDC88A-siRNA und dem miR-199b-3p-Inhibitor co-transfiziert wurden, wurden durch RT-qPCR nachgewiesen. (L) Die proliferative Aktivität von MG63-Zellen, die mit CCDC88A-siRNA und dem miR-199b-3p-Inhibitor co-transfiziert wurden, wurde durch den MTT-Assay nachgewiesen. (M) Die proliferative Aktivität von U2OS-Zellen, die mit CCDC88A-siRNA und dem miR-199b-3p-Inhibitor co-transfiziert wurden, wurde durch den MTT-Assay nachgewiesen. (N) Die invasive Aktivität von MG63- und U2OS-Zellen, die mit CCDC88A-siRNA und dem miR-199b-3p-Inhibitor co-transfiziert wurden, wurde durch den Transwell-Assay bestimmt. *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001. miR-microRNA, CCDC88A-Coiled-Coil-Domäne mit 88A, untranslatierte UTR-Region, siRNA Small Interfering RNA, RT-qPCR Reverse Transkription-quantitative Polymerasekettenreaktion, MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid, KD-Knockdown, NC-Negativkontrolle, optische OD-Dichte, Wildtyp, Mutant, ns nicht signifikant, CDS-Kodierungssequenz. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Die Knockdown-Effizienz von CCDC88A wurde durch RT-qPCR-Analyse untersucht (Abb. 4H, I). Es wurde festgestellt, dass die CCDC88A-Expression nach der Transfektion mit miR-199b-3p-Inhibitoren in MG63- und U2OS-Zellen im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe erhöht war; Bei Cotransfektion mit miR-199b-3p-Inhibitoren war sie jedoch umgekehrt erhöht (Abb. 4J, K). Die Ergebnisse der MTT-Assays zeigten, dass die Proliferation von OS-Zellen durch die Unterdrückung der CCDC88A-Expression umgekehrt werden könnte (Abb. 4L, M). Die Ergebnisse des Transwell-Assays zeigten, dass die Invasion von OS-Zellen durch die Unterdrückung der CCDC88A-Expression umgekehrt werden könnte (Abb. 4N).

Die Proteinspiegel von β-Catenin, E-Cadherin, c-Myc, Cyclin D1, Vimentin und N-Cadherin wurden in OS-Zellen nachgewiesen, die miR-199b-3p überexprimieren. Es wurde gezeigt, dass bei Unterdrückung der miR-199b-3p-Expression in OS-Zellen die Expressionsniveaus aller oben genannten Schlüsselproteine ​​mit Ausnahme von E-Cadherin erhöht waren (Abb. 5A). Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass CCDC88A, reguliert durch miR-199b-3p, die Tumorproliferation und -invasion im OS über die EMT- und Wnt/Beta-Catenin-Signalwege induzierte (Abb. 5B).

Die miR-199b-3p/CCDC88A-Achse reguliert das bösartige Verhalten von OS-Zellen über den Wnt/β-Catenin-Weg und den EMT-Prozess in vitro. (A) Die Hemmung der Expression von miR-199b-3p aktiviert den Wnt/β-Catenin-Signalweg und den epithelial-mesenchymalen Übergangsprozess. (B) Die miR-199b-3p/CCDC88A-Achse reguliert das bösartige Verhalten von OS-Zellen über den Wnt/β-Catenin-Weg und den EMT-Prozess. *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001. miR-microRNA, CCDC88A-Coiled-Coil-Domäne mit 88A, OS-Osteosarkom, EMT-Epithel-zu-Mesenchym-Übergang, UTR-untranslatierte Region, EMT-Epithel-Mesenchym-Übergang. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Hinweis: Während der Entwicklung der Western-Blot-Elemente wurden die Kanten einiger Elemente aufgrund der Belichtungs- und Kontrastanpassung nicht klar auf den Bildern angezeigt.

Als neuartiger Regulator ist miR-199b-3p von besonderer Bedeutung für die Tumorentstehung in einer Vielzahl von Tumoren14,15. Darüber hinaus behinderte die Überexpression von miR-199b-3p die Proliferation von Darmkrebszellen und induzierte deren Apoptose durch Verringerung des cysteinreichen Motoneurons 1 (CRIM1) über den Wnt/Beta-Catenin-Weg15. Bei Prostatakrebs wurde berichtet, dass miR-199b-3p auf Phospholipase c-epsilon abzielen und somit die maligne Proliferation unterdrücken kann8. Es wurde auch gezeigt, dass eine geringere miR-199b-3p-Expression mit einer schlechten Prognose von Patienten mit Prostatakrebs korreliert14.

In der vorliegenden Studie wurde GSE65071 aus der GEO-Datenbank analysiert und die Daten zeigten, dass die Expressionsniveaus von miR-199b-3p im Betriebssystem herunterreguliert waren. Dieser Befund wurde anschließend in OS-Zelllinien verifiziert. In den 49 Fällen mit OS waren die Expressionsniveaus von miR-199b-3p in Krebsgeweben ebenfalls signifikant niedriger als in parakanzerösen Geweben. Basierend auf den Gewebedaten des Patienten wurde eine ROC-Kurvenanalyse verwendet, um den AUC-Wert zu ermitteln, der auf 0,67 geschätzt wurde, was darauf hinweist, dass miR-199b-3p ein empfindlicher diagnostischer Prädiktor für das OS war. Um die biologischen Funktionen von miR-199b-3p zu untersuchen, wurden MTT- und Transwell-Assays implementiert. Es zeigte sich, dass die Proliferation und Invasion nach der Hochregulierung von miR-199b-3p in MG63- und U2OS-Zelllinien gehemmt wurde. Laut der Kaplan-Meier-Analyse war eine geringere miR-199b-3p-Expression mit einer kürzeren Gesamtüberlebenszeit verbunden. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR-199b-3p seine Funktion als Tumorsuppressor bei Prostatakrebs, Darmkrebs und Blasenkrebs ausübt, während es bei Bauchspeicheldrüsenkrebs als Onkogen fungiert14,15,22. Basierend auf diesen Erkenntnissen untersuchte die vorliegende Studie das potenzielle Ziel von miR-199b-3p im OS.

In der vorliegenden Studie wurde von TargetScan festgestellt, dass miR-199b-3p eine potenzielle Bindungsstelle mit CCDC88A besitzt. Es wurde berichtet, dass CCDC88A eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression spielt, und es wurde auch bestätigt, dass es in Tumoren als Onkogen fungiert23. Basierend auf diesen Studien wird gefolgert, dass CCDC88A an der Tumorprogression verschiedener Krebsarten, wie Brust-, Dickdarm- und Gebärmutterhalskrebs, beteiligt ist24,25,26. Es wurde auch berichtet, dass CCDC88A an der Bildung des Aktin-Zytoskeletts beteiligt ist und die Akt-Phosphorylierung verstärkt. Außerdem wirkt es stromabwärts des PI3K/Akt-Signalwegs und wird direkt durch Akt27 aktiviert. Berichten zufolge kann CCDC88A auch an Gαi3 binden und dieses aktivieren, was den PI3K/Akt-Signalweg28 weiter aktiviert. Ein Glioblastomforscher hat außerdem bestätigt, dass die CCDC88A-Expression eng mit der Malignität des Tumors zusammenhängt, einschließlich des histologischen Grades und der Metastasierung sowie des progressionsfreien Überlebens und des Gesamtüberlebens29. Bei menschlichem Darmkrebs war CCDC88A mit dem TNM-Tumorstadium und der Häufigkeit von Lebermetastasen und anderen Fernmetastasen assoziiert30. Die Wirkung von CCDC88A auf das Fortschreiten des OS und sein Regulierungsmechanismus bleiben jedoch unklar. Bisher wurde CCDC88A nicht im Betriebssystem untersucht. In unserer Studie wurde festgestellt, dass die relative Expression von CCDC88A in OS-Geweben signifikant höher ist und auch mit einem schlechten Gesamtüberleben verbunden ist. Der Zusammenhang zwischen CCDC88A und miR-199b-3p wurde in der vorliegenden Studie durch Luciferase-Reporter-Assays bestätigt. Noch wichtiger ist, dass beobachtet wurde, dass die CCDC88A-Expressionsniveaus in OS-Zelllinien mit hochregulierten miR-199b-3p-Niveaus verringert waren. Dies zeigte, dass miR-199b-3p und CCDC88A eine negative Assoziation aufwiesen, was mit den Ergebnissen in den klinischen Proben übereinstimmte. Bemerkenswerterweise wurde festgestellt, dass CCDC88A die durch die Induktion von miR-199b-3p verursachte Hemmwirkung teilweise umkehren konnte. Die vorliegende Studie zeigte, dass miR-199b-3p an CCDC88A binden und dessen hemmende Wirkung auf die Proliferation und Invasion der OS-Zelllinien umkehren kann.

Anschließend wurde auch der molekulare Mechanismus der Regulierung der OS-Aggressivität durch die miR-199b-3p/CCDC88A-Achse untersucht. Es wurde berichtet, dass miR-199b-3p die Proliferation und Invasion bei Darmkrebs über den Wnt/Beta-Catenin-Signalweg modulieren kann, indem es auf CRIM115 abzielt. Es wurde auch gezeigt, dass der Wnt/Beta-Catenin-Weg die Proliferation und Differenzierung von Krebszellen erleichtern kann, die eine grundlegende Rolle bei der Tumorentstehung spielen31. In der vorliegenden Studie deuten die Daten darauf hin, dass miR-199b-3p die OS-Zellproliferation über den Wnt/β-Catenin-Weg hemmen kann. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen einer früheren Studie überein. Aufgrund verminderter Zell-Zell-Adhäsionskomplexe gilt die EMT als embryonaler Prozess. Es verleiht Zellen verbesserte Migrations- und Invasionseigenschaften und fördert die Tumormetastasierung32. Krebszellen können EMT-Veränderungen aufgrund niedriger Expressionsniveaus von E-Cadherin und hoher Expressionsniveaus von N-Cadherin und Vimentin aufweisen33. Im Jahr 2021 wurde berichtet, dass miR-199b-3p die EMT hemmen und eine Funktionsstörung der Nierentubuli bei diabetischer Nephropathie verursachen könnte34. In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass miR-199b-3p die Zellinvasion über EMT im OS beeinflussen kann.

Insgesamt zeigte die vorliegende Studie zum ersten Mal, dass die miR-199b-3p/CCDC88A-Achse die OS-Entwicklung über den EMT-Prozess und den Wnt/Beta-Catenin-Weg reguliert. Allerdings weist die vorliegende Studie gewisse Einschränkungen auf. Es handelte sich um eine retrospektive Studie, die in vitro durchgeführt wurde und möglicherweise nicht das Verhalten von OS in vivo widerspiegelt; Da nur 49 Fälle eingeschlossen wurden, war die Stichprobengröße klein und die Generalisierbarkeit möglicherweise eingeschränkt. Daher sollten zukünftige Studien diese Einschränkungen berücksichtigen.

Zusammenfassend deuten die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hin, dass die miR-199b-3p/CCDC88A-Achse eine wichtige Rolle beim Fortschreiten des OS spielen könnte, indem sie die EMT- und Wnt/Beta-Catenin-Signalwege beeinflusst.

Die in der vorliegenden Studie generierten Datensätze können beim entsprechenden Autor angefordert werden.

Zhu, D., Xu, Exp. Dort. Med. 22, 1339 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eaton, BR, Schwarz, R., Vatner, R., Yeh, B. & Claude, L. Osteosarkom. Pädiatr. Blutkrebs 68 (Ergänzung 2), e28352 (2021).

PubMed Google Scholar

Sadykova, LR & Ntekim, AI Epidemiologie und Risikofaktoren des Osteosarkoms. Krebsforschung. 38, 259–269 (2020).

Artikel Google Scholar

Ritter, J. & Bielack, SS Osteosarkom. Ann. Onkol. 21 (Suppl 7), vii320–vii325 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Li, Z. & Rana, TM Therapeutisches Targeting von microRNAs: Aktueller Status und zukünftige Herausforderungen. Nat. Rev. Drug Discov. 13, 622–638 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yuan, Y. et al. ALKBH5 unterdrückt das Fortschreiten des Tumors durch eine m(6)A-abhängige epigenetische Stummschaltung der Prä-miR-181b-1/YAP-Signalachse beim Osteosarkom. Zelltod-Dis. 12, 60 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiao, Z. et al. Hsa-miR-557 hemmt das Wachstum von Osteosarkomen, indem es auf KRAS abzielt. Vorderseite. Genet. 12, 789823 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Soghli, N. et al. MicroRNAs und Osteosarkom: Mögliche Ziele zur Hemmung der Metastasierung und Erhöhung der Chemosensitivität. Biochem. Pharmakol. 201, 115094 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deng, Y., Zhao, F., Zhang, Z., Sun, F. & Wang, M. Lange nichtkodierende RNA SNHG7 fördert das Tumorwachstum und den Übergang vom Epithel zum Mesenchym durch Regulierung von miR-34a-Signalen bei Osteosarkomen. Krebsbiother. Radiopharm. 33, 365–372 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

He, P., Xu, YQ, Wang, ZJ & Sheng, B. LncRNA LINC00210 regulierten die Strahlenempfindlichkeit von Osteosarkomzellen über die miR-342-3p/GFRA1-Achse. J. Clin. Labor. Anal. 34, e23540 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sahin, Y. et al. Die Hemmung von miR-664a stört die Migration von Osteosarkomzellen durch Modulation von MEG3. Biochem. Biophys. Res. Komm. 490, 1100–1105 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gong, Y. & Wei, ZR MiR-659-3p hemmt das Fortschreiten und die Metastasierung von Osteosarkomen, indem es die Zellproliferation und -invasion über die Ausrichtung auf SRPK1 hemmt. BMC Krebs 22, 934 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, X. et al. MiR-183 hemmt das Wachstum und die Invasion von Osteosarkomzellen, indem es den LRP6-Wnt/β-Catenin-Signalweg reguliert. Biochem. Biophys. Res. Komm. 496, 1197–1203 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, J., Quan, Z., Gao, Y., Wu, Biochem. Biophys. Res. Komm. 576, 73–79 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Han, H. et al. miR-199b-3p trägt zur erworbenen Resistenz gegen Cetuximab bei Darmkrebs bei, indem es über die Wnt/β-Catenin-Signalisierung auf CRIM1 abzielt. Krebszelle Int. 22, 42 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kitamura, T. et al. Regulierung der VEGF-vermittelten Angiogenese durch das Akt/PKB-Substrat Girdin. Nat. Zellbiol. 10, 329–337 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tanouchi, A. et al. CCDC88A, ein Prognosefaktor für menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebserkrankungen, fördert die Motilität und Invasivität von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. J. Exp. Klin. Krebs Res. 35, 190 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, J., Enomoto, A., Weng, L., Sun, L. & Takahashi, M. Die Dephosphorylierung von Girdin durch PP2A hemmt die Metastasierung von Brustkrebs. Biochem. Biophys. Res. Komm. 513, 28–34 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, X. & Enomoto, A. Girdin/GIV reguliert die kollektive Migration von Krebszellen durch die Kontrolle der Zelladhäsion und der Zytoskelettorganisation. Krebswissenschaft. 109, 3643–3656 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cates, JMM Das einfache Staging-System für Osteosarkome funktioniert genauso gut wie die AJCC- und MSTS-Systeme. J. Orthop. Res. 36, 2802–2808 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Mu, J., Fan, L., Liu, D. & Zhu, D. Eine Überexpression von Shugoshin1 sagt eine schlechte Prognose für Prostatakrebs voraus und fördert die Metastasierung durch Beeinflussung des epithelial-mesenchymalen Übergangs. Onco zielt auf Ther. 12, 1111–1118 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakaguchi, T. et al. Regulierung von ITGA3 durch die doppelsträngige microRNA-199-Familie als potenzieller prognostischer Marker bei Blasenkrebs. Br. J. Cancer 116, 1077–1087 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Enomoto, A., Ping, J. & Takahashi, M. Girdin, ein neuartiges Aktin-bindendes Protein, und seine Proteinfamilie besitzen vielseitige Funktionen in den Akt- und Wnt-Signalwegen. Ann. NY Acad. Wissenschaft. 1086, 169–184 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Jiang, P. et al. Ein Aktin-bindendes Protein Girdin reguliert die Motilität von Brustkrebszellen. Krebs Res. 68, 1310–1318 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Barbazan, J. et al. Prognostischer Einfluss von Modulatoren von G-Proteinen in zirkulierenden Tumorzellen von Patienten mit metastasiertem Darmkrebs. Wissenschaft. Rep. 6, 22112 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, P., Ren, YL, Li, JL & Luo, J. Girdin-Expression beim Gebärmutterhalskarzinom und ihre Rolle bei den bösartigen Eigenschaften von HeLa-Zellen. Oncol Lett. 11, 2440–2444 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garcia-Marcos, M. et al. Die Expression von GIV/Girdin, einem metastasierungsbezogenen Protein, sagt das Überleben des Patienten bei Dickdarmkrebs voraus. FASEB J. 25, 590–599 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ghosh, P., Garcia-Marcos, M., Bornheimer, SJ & Farquhar, MG Die Aktivierung von Galphai3 löst die Zellmigration über die Regulierung von GIV aus. J Cell Biol. 182, 381–393 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, F. et al. Girdin, ein Aktin-bindendes Protein, ist entscheidend für die Migration, Adhäsion und Invasion menschlicher Glioblastomzellen. J. Neurochem. 131, 457–469 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jun, BY et al. Expression von Girdin bei menschlichem Darmkrebs und sein Zusammenhang mit der Tumorprogression. Dis. Colon Rectum 56, 51–57 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Zhang, Y. & Wang, X. Targeting des Wnt/β-Catenin-Signalwegs bei Krebs. J. Hämatol. Onkol. 13, 165 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

De Craene, B. & Berx, G. Regulierungsnetzwerke, die EMT während der Krebsentstehung und -progression definieren. Nat. Rev. Cancer 13, 97–110 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Goossens, S., Vandamme, N., Van Vlierberghe, P. & Berx, G. EMT-Transkriptionsfaktoren bei der Krebsentstehung neu bewertet: Jenseits von EMT und MET. Biochim. Biophys. Acta 1868, 584–591 (2017).

CAS Google Scholar

Bai, S. et al. hsa-miR-199b-3p verhindert den epithelial-mesenchymalen Übergang und die Funktionsstörung des Nierentubulus, indem es E-Cadherin reguliert, indem es auf KDM6A bei diabetischer Nephropathie abzielt. Oxid. Med. Zelle. Longev. 2021, 8814163 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Dongsheng Zhu und Han Qi.

Abteilung für Kinderchirurgie, Erstes Volkskrankenhaus von Lianyungang, 182 Tongguan North Road, Lianyungang, 222000, Jiangsu, Volksrepublik China

Dongsheng Zhu und Hongqi Zhu

Abteilung für Notfallchirurgie, Zweites Volkskrankenhaus von Lianyungang, 41 Hailian East Road, Lianyungang, 222000, Jiangsu, Volksrepublik China

Han Qi

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

HQ, DZ und HZ haben die Experimente entworfen. DZ führte die Experimente durch. Das Hauptquartier sammelte die Proben der Patienten. DZ hat das Manuskript erstellt. DZ und HZ überarbeiteten das Manuskript kritisch hinsichtlich wichtiger intellektueller Inhalte. DZ unterstützte uns bei der statistischen Analyse. DZ und HZ bestätigen die Authentizität aller Rohdaten. Alle Autoren bestätigten die Authentizität aller Rohdaten und genehmigten die endgültige Fassung des Manuskripts.

Entsprechung zu Dongsheng Zhu oder Han Qi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhu, D., Qi, H. & Zhu, H. hsa-miR-199b-3p unterdrückt das Fortschreiten des Osteosarkoms, indem es auf CCDC88A abzielt, den Übergang vom Epithel zum Mesenchym und den Wnt/Beta-Catenin-Signalweg hemmt. Sci Rep 13, 12544 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39537-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 12. März 2023

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39537-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.